產物的結果不專一嗎? 來試試Touchdown PCR!!!!!!

整理・撰文：盛威智

PCR技術在現今的生技領域中已被廣泛的使用，然而在做實驗時，時常會遇到非專一性產物產生的情況，影響到我們對結果的判讀，原因有可能是Primer設計的不好、template可能有較多的GC-Rich或是annealing選定的溫度不適當等等。

過去你可能會選擇加入一些添加劑 (如DMSO、Betaine、formamide) 或是重新去抓合適的annealing條件。而今天要跟大家介紹的是一項可以將我們不理想的結果，在設定條件時直接優化的技術，那就是遞減式聚合酶鏈鎖反應。

遞減式聚合酶鏈鎖反應(Touchdown polymerase chain reaction)， TD-PCR，其原理為在反應一開始採用較高的 annealing 溫度條件來進行反應，當溫度高於primer的Tm值狀態下，此時唯有序列相似度極高的DNA才較有機會進行黏合（Tm，melting temperature：在某溫度下，DNA有50%變性成單股而另50%為雙股時，則稱此溫度為Tm），雖然只有較少的primer可以黏上template，但能確保初期產物的專一性。接著在後面的反應cycle中，逐漸降低 annealing 溫度，去逐漸提升能黏上template的primer數量，最後再以較低溫的條件重複幾個cycle，以增加反應產物的放大效率。這樣隨著反應循環來改變引子annealing的策略，便可以增加 PCR 產物的專一性。

圖片來源: http://welgene.pixnet.net/blog/post/98301752-%5B%E8%A9%A6%E5%8A%91%E8%80%97%E6%9D%90%5Dpcr%E5%AF%A6%E9%A9%97%E5%BF%83%E6%B3%95-%3A-%E9%81%9E%E6%B8%9Bpcr-(touchdown-pcr)---

以下表格為示範的PCR設定條件，前25個Cycle將從72°C開始，每個Cycle將逐漸降低0.5°C，直至降到60°C時，再反應20個Cycle

                          

Cycle	步驟	溫度	時間
階段一
1	Predenature	94°C	5 min
階段二
1	Denature	94°C	1 min
25	Annealing	72°C	30 sec
1	Elongation	72°C	1 min
階段三
1	Denature	94°C	1 min
20	Annealing	60°C	30 sec
1	Elongation	72°C	1 min
階段四
1	Elongation	72°C	5 min
1	Stop reaction and Hold	14°C	直到將tube從機器取出

學會了TD-PCR後，是否受益良多呢？往後遇到想避免非專一性產物的產生時，運用TD-PCR只要經過幾道簡單的設定，不必花心思再去改變反應溶液中各成分或是添加劑的濃度，就可以達到產物專一的效果喔，甚至有時候還能避免要再重新設計primer的問題呢!

資料來源:

1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18772872

2. https://zh.wikipedia.org/zh-tw/%E9%81%9E%E6%B8%9B%E8%81%9A%E5%90%88%E9%85%B6%E9%8F%88%E5%BC%8F%E5%8F%8D%E6%87%89

3. https://smallcollation.blogspot.tw/2013/08/dnadnas-denaturation.html#gsc.tab=0