整理・撰文：鄭宇恆、郭芷麟
相信有在做實驗的大家對此技術並不陌生，那如果還沒使用過這個技術，也應該有做過一般的 PCR 實驗吧！一般的 PCR實驗，我們都是用來擴增微量的 DNA，而此技術的原理也是一樣的，只是多了在PCR 反應溶液中添加螢光物質 (DNA binding dye or Probe)，當反應循環數增加，目標 DNA 產物濃度也會以倍數成長，再藉由儀器偵測每個 cycle 所產生的螢光訊號。藉由電腦分析 PCR cycle 與螢光讀值間的關係，即可進行實驗結果的判讀!
所以 Real - time
PCR 跟一般傳統PCR 最大的不同就是：Real - time PCR 會透過光學系統去偵測每個 cycle 間螢光讀值的變化，來達到即時偵測目標產物的變化量！所以相較於一般 PCR (End – point PCR)，Real – time PCR 重視的是樣品增幅過程目標產物的變化，而非最終產量。
目前 Real -
time PCR 具有兩種系統：
1.
非探針型, DNA binding dye system：
目前市面上常見的fluorescence DNA binding dye為SYBR Green，當 SYBR Green 嵌入雙股 DNA 時，可經由激發偵測其螢光表現；隨著 PCR cycle 的進行，雙股 DNA 含量會隨之上升，進而促使螢光訊號的增加。但是，因為 SYBR
Green 與 DNA 的結合為非專一性反應，因此只要是 primer dimer 或者非專一性產物被放大出來就有可能與 DNA binding dye 結合產生螢光訊號。所以使用前必須先確認 PCR 產物的專一性，否則很容易造成實驗誤判。
2.
探針型Probe system：
這個是具有專一性的系統。而不同的系統，所使用的探針又可以分為數種不同的形式。
其中，最基本的原理為利用 PCR 產物的序列來設計一段互補的核酸探針，並在探針的兩端接上能階相差許多的兩種螢光物質，稱為 reporter 及 quencher。利用 FRET (Fluorescence resonance
energy transfer) 原理，當 reporter 與 quencher 距離相近時 reporter
散發的螢光會因為 quencher
的遮蔽效應而無法被偵測。而當 DNA 在擴增的時候，聚合酶會碰到黏附在目標序列上的探針，此時聚合酶會啟動水解功能 (5’→3’ exonuclease
activity) 將探針水解，使得
reporter 與
quencher 分離，進而偵測其螢光訊號。
Probe system 優勢為具有良好的專一性且可以同時針對單一樣品進行多目標序列檢測，對於臨床診斷等工作特別受歡迎；其缺點為合成螢光探針的價格昂貴、設計複雜且需要花費較多的心力去進行效能確認。因此學術導向的實驗室還是以 SYBR Green 系統的 qPCR 試劑為主要選擇。
瞭解了即時聚合酶連鎖反應的基本知識之後，有沒有體會到他比傳統 PCR 來的方便啊！他的偵測範圍廣、靈敏度高、快速以及鑑定的專一性都比傳統 PCR更具優勢，還可以在電腦上即時呈現實驗結果。除此之外，Real-time PCR 還可精確定量目標 DNA 的初始濃度，這對於細菌所引發的疾病檢測及抗生素投藥劑量更具意義。而對於偵測感染病患的病原體檢測、癌症監測、診斷個別基因差異的用藥反應、染色體畸變的分析與基因表達分析等應用也具有相當大的效益。
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