Ten Giga Bio : 你不可不知道的 PCR 小技巧 —

整理・撰文：楊孟勳、郭芷麟

其實不論做任何實驗，最常碰到的實驗技巧一定都是 PCR。PCR 的發明帶給人類科學研究上許多便利。在我們開始學實驗技術時，就算知道實驗的基礎原理，還是會有許多不同的實驗結果產生。要克服這些問題，除了自己努力嘗試各種方式之外，也可以依靠專業人士的經驗傳承。

在這裡，就來分享一個只要 PCR 失敗過一次就會用到，改善 PCR 非專一性產物的最簡單方法——熱啟動聚合酶連鎖反應 (Hot start PCR)。

首先先讓我們了解一下，primer dimer 是如何產生的呢?

在 PCR 反應溶液中的 primer 會互相碰觸，就會有非常大的機會與互補的鹼基相黏產生雙股，之後就會被聚合酶作用放大，產生所謂 primer dimer 的現象。相信只看文字可能還是不太清楚，這裡小編提供一部影片（https://www.youtube.com/watch?v=hyqORD3YmNE）詳細介紹primer dimer是如何發生的。

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Primer_dimers_formation_En.PNG

根據影片以及圖片的介紹，我們已經知道 primer dimer 產生的原因。相信大家都很好奇為何 Hot start PCR 可以解決這件事呢? 故事要從primer 的鹼基說起，只要知道這點，後面自然就融會貫通了！

都知道DNA互補的鹼基越多越容易相黏且黏性越強吧！？拿 primer 來說，PCR 的 primer 互補鹼基所佔的比例非常的少 (有例外)，通常只有幾個 mer，所以稍微加熱就會被 denature；反過來說 primer 自黏只會發生在低溫 (常溫)，所以我們只要避免聚合酶在 primer 自黏情況下作用，就能減少 primer dimer 發生機率啦！聰明的科學家當然知道這些利害關係，所以 Hot start PCR 這樣簡單的技術就被設計出來了！

有幾種常見的方式，在這裡小編將他分為兩大類：隔離法以及抑制法。

1. 隔離法

傳統法的想法比較直接，它採用比較主動的方式去避免 primer dimer 產生。

手動法：讓聚合酶 or Mg²⁺ 與其它組成分離，等溫度夠高 primer 完全解離後再添加，藉此避免 PCR 反應在常溫下的作用而產生 primer dimer。
蠟隔絕法：先添加除了聚合酶 or Mg²⁺外的試劑，滴一滴蠟(ex:石蠟)，待蠟凝固後再添加主要物質，利用蠟達到隔絕的目的，等溫度升高蠟融化，管中的試劑才會混合開始作用。

2. 抑制法

抑制法是比較新的 Hot start 策略，它直接在聚合酶上動手腳，原理類似抗體抗原結合抑制聚合酶活性，一旦試劑內添加的抑制劑 (antibody、affibody、aptamer) 與聚合酶結合，聚合酶則會失去活性。那我們要如何讓聚合酶恢復活性呢?原來，我們的抑制劑都是不耐熱的，所以當溫度升高就會變性，變性後的抑制劑結構改變當然也就無法繼續與聚合酶結合啦！此時聚合酶就恢復活性了。如果還是不懂的話，這裡附有影片（https://www.youtube.com/watch?v=5mNEfPiXTvc）請大家參考～其實小編覺得還是看影片比較有趣！