唯有不斷尋求，才有機會找到答案——探索未知的 RNA 區段-RACE

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整理・撰文：李俊廷

在顯赫的山壁、巖然的未踏之地上，攀岩者抱持著敬畏的心，以看似樸實卻不失細膩的動作將一個個勾環釘入岩壁。這種逐步探尋未知地帶的模式，在分子生物技術中也見得到。

今天要來跟各位介紹的技術是快速擴增 cDNA 末端 (Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)。如果說在字面上 “RT-PCR vs. Real-time PCR 還在傻傻分不清楚？” 的話，那 RT-PCR 跟 RACE 就是在用途上，容易讓人混淆吧！

雖然 RACE 為 RT-PCR 的變奏版，在原理跟步驟上和 RT-PCR 有很多相似，但 RACE 卻能解決很多特別的問題。例如，分析兩端序列未知的 RNA、界定啟動子 (promoter) 下游、調查部分胺基酸序列已知的基因等…

快速擴增 cDNA 末端 (Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)，不要被這長長的名稱嚇到了！其實簡單來說，就是一種可以用來幫助你尋找 RNA 末端未知序列的技術。一般來說，我們會依照分析的端點而將 RACE 分成 3’ RACE 和 5’ RACE 兩種。下面以幾個簡單的例子分別說明：

3’ RACE 及 5’ RACE 的流程：

3’ RACE

圖二. 3’ RACE 分析真核生物 mRNA

以分析某個真核生物特定基因的 mRNA 3’ 端為例，首先會藉由 poly-T 引子將具有 poly-A tail 的 mRNA 做為模板，反轉錄成第一股 cDNA (first-strand cDNA)。poly-T 引子在設計上 3’ 端有時會多帶一個 V (V = A or C or G)，藉此增加黏合在 poly-A 與基因交界處的機率，以免 poly-T 引子黏合在離基因太遠的 poly-A 區段上。

隨後利用目標基因的 Gene-Specific Primer (GSP)，並以first-strand cDNA 為模板，合成第二股 cDNA (second-strand cDNA)。取得含 3’ 端未知序列的 cDNA 後，我們可以利用 poly-T 引子與 GSP 擴增產物，定序先前未知的 mRNA 3’ 端。說到這，不知大家會不會想到一個問題：如果我們的目標 RNA 沒有 poly-A tail該怎麼辦呢？像是例如非編碼 RNA (non-coding RNA, ncRNA) 或原核生物的mRNA……等。

這時就可以利用 poly-A polymerase 將目標 RNA 3’ 端加上 poly-A，用來仿照真核生物的 mRNA 3’ 端，就可以解決這樣的問題囉！另外，一般的反轉錄酵素在面對太長的 RNA 目標時，往往會後繼無力而無法合成整段 first-strand cDNA。所以如果設計的 GSP 位置距離 RNA 3’端太遠，以 poly-T 引子合成的 first-strand cDNA 可能就無法包含能被 GSP 辨識的區域。

想要解決這樣的問題，其中一種解決的策略是：先使用隨機引子 (random primers) 合成多種 first-strand cDNA，這些 first-strand cDNA 當中可能有些是包含部分未知序列且能被 GSP 辨識的。搭配 random primer 配合 GSP 擴增產物並定序取得部分未知序列的資訊後，就能設計更靠近 RNA 3’ 端的 GSP 來分析剩下未知的區域。

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5’ RACE 

圖三. 5’ RACE 分析原核生物 mRNA 範例圖

這部分，我們以分析某個原核生物特定基因的 mRNA 5’ 端為例。

首先用 GSP 合成 first-strand cDNA 後，通常會以末端脫氧核苷酸轉移酶 （Terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT） 在 first-strand cDNA 3’ 端加上一段能夠被引子辨識的標靶序列 (adapter)。

所謂的TdT 是一種不需要模板就能合成 DNA 的聚合酶，因此可以直接在 first-strand cDNA 3’ 端加上一段序列，這段序列可以依照我們給予的 dNTP 原料來決定，例如如果給予 poly-C。之後就能以 poly-G 引子來合成 second-strand cDNA。

poly-G 引子在設計上 3’ 端有時會帶一個 H (H = A or T or C)，藉此增加黏合在 poly-C 與基因交界處的機率。取得含完整 5’ 端的雙股 cDNA 產物後，以 poly-G 引子與 GSP 擴增目標產物，就可以將未知的 5’ 端序列定序出來了！

如果 GSP 的位置距離 RNA 5’ 端太遠而無法合成含完整 5’ 端的 first-strand cDNA，也能繼續以互補 adapter 的引子先合成 second-strand cDNA，再用 GSP 配合能互補 adapter 的引子擴增含部分未知序列的產物，定序取得更多資訊後就能設計更接近 5’ 端的 GSP。

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RACE 在實作上也有相當多的花招，當我們覺得 RACE 的產物不夠專一時，可以藉由巢式聚合酶鏈鎖反應 (Nested PCR) 的概念，將原先使用的 GSP 替換成另一種新的 GSP 並進行第二次擴增 (詳見“房屋仲介”有巢氏”，PCR也有巢式!”)。或是當我們覺得用 TdT 製造 adaper 的步驟太繁瑣時，亦可選用能在產物 3’ 端額外添加 adapter 的反轉錄酵素產品。

在應用面上，RACE 也佔有重要的地位。除了能夠藉由 5’ RACE 來分析啟動子外 （promoter），也能以某個蛋白的特徵序列設計退化性引子 (degenerate primer) ¹作為 GSP，再藉由 RACE 將某個系列的蛋白從 RNA pool 釣出來。

另外，實驗設計上，RACE 產物的取向較 RT-PCR 集中，因此能夠建立較小的 cDNA 文庫 (cDNA library)，利於我們進一步的篩選。而當目標 RNA 過大而無法以 RT-PCR 分析全長時，我們也能以 RACE 逐步分段地對整條目標 RNA 進行分析。見圖四：

圖四. 以 RACE 對 Long-RNA 逐步進行定序。

雖然目前具有高通量的次世代定序分析，奪去了 RACE 的部分風采，但秉持著能夠穩健、輕巧分析的優勢，RACE 至今仍被許多實驗室應用。經過小編今天的介紹之後，大家對於 RACE 有沒有比較熟悉了呢？

名詞解釋：

退化性引子 (degenerate primer)：用已知的胺基酸序列逆推可能的核酸序列，再以此資訊設計出對應的引子群。例如：TENGIGA 胺基酸序列可對應到的 DNA 序列為 ACN GAR AAY GGN AUH GGN GCN：

T (ACU, ACC, ACA, ACG)

E (GAA, GAG)

N (AAU, AAC)

G (GGU, GGC, GGA, GGG)

I (AUU, AUC, AUA)

G (GGU, GGC, GGA, GGG)

A (GCU, GCC, GCA, GCG)

參考資料：

1. 維基百科：https://en.wikipedia.org/wiki/Rapid_amplification_of_cDNA_ends
2. Michael J. McPherson, Simon Geir Møller (2006). PCR (Second Edition) pp 47-50. In US: 270 Madison Avenue New York, N Y 10016, In UK: 4 Park Square, Milton Pa. Taylor & Francis Group.
3. http://download.bioon.com.cn/view/upload/201201/18181845_7261.pdf