你用過嗎？PCR 界的革命新技術！——Recombinase Polymerase Amplification

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整理・撰文：郭芷麟

想一下，是不是每次實驗要做 PCR，我們幾乎都會再安排其他實驗？或是在接近中午的時間點上機，吃飽飯之後再來收 sample？

會有這樣預期心理的產生，就是因為我們知道上機之後，大約需要花費 1.5~2 個小時左右的時間等熱循環儀 （ thermal cycler） 來完成反應。雖然 PCR 的發明已經促使我們的研究得以更有效且方便的完成，然而科學家的追求創新的決心，是不可容小看的！

在 2003 年，英國 TwistDx Inc 公司提出了一項技術專利的申請。這項技術就是：重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）。讓人心動的是，這是一種可以在常溫下反應，且只要 15 分鐘就可以完成 PCR 反應的一項技術！

這項技術非常的簡單，只需要 3 種 enzymes 就可以完成反應，分別是：能結合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶（a recombinase）、單鏈DNA結合蛋白（a single-stranded DNA-binding protein, SSB）以及鏈置換DNA聚合酶（strand-displacing polymerase）。這三種酶在常溫下也具有活性，且最佳反應溫度為 37°C（37°C - 42°C之間皆可）。也就是說，平常在室溫下就可以做 PCR，不用再提早上機或是排隊等 PCR 機器了！

不只所需的材料簡單，它的原理其實也滿簡單的。將你的 sample 與這三種酶在 tube 中混合之後，就會發生下列步驟，過幾十分鐘之後，可以得到放大後的產物囉！

1.     一開始，管中的 recombinase 也就是一種 genetic recombination enzymes，他會去辨認 oligonucleotide primer 的序列，進而形成 complex，再鍵結到 homologous DNA 上。這樣的鍵結，會造成一個 D-loop的構形形成，產生出 single-stranded DNA。

2.     此時會有所謂的 single-stranded DNA-binding protein (SSB) 鍵結到這些 single-stranded DNA 上，進而去穩定這樣的一個中間產物。之後，polymerase 就會取代原本鍵結的 recombinase。

3.     polymerase 就會藉由 forward primer 和 reverse primer 與目標序列的鍵結，開始放大出新的雙股 DNA。重複上述的步驟，我們就可以得到大量的產物囉！

搭配圖片研究一下，會比較了解喔！如果還是不太能理解，請點選影片連結觀看～影片連結：https://youtu.be/tV8DvDqcoZE

而這樣方便又有效的技術出現之後，當然引起各領域的科學家的討論以及應用。雖然如此，但再厲害的技術，有時還是無法完成所有的實驗條件。大家可以猜猜，這樣神奇的技術，可以做怎樣的應用以及會有怎樣的缺點？下星期將為大家揭曉～

資料來源：

1.     TwistDx Inc 官網：http://www.twistdx.co.uk/our_technology/

2.     維基百科：Recombinase Polymerase Amplification

3.     壹讀部落格：核酸檢測的一場革命，可替代PCR的犀利技術

4.     Olaf Piepenburg,et al. PLOS BIOLOGY, June , 2006