面對難關，不可或缺的夥伴們——PCR Additives & Enhancers

整理・撰文：梁博任

各位在忙完實驗的閒暇時間，是否會安排休閒活動好好的犒賞一下自己並充充電呢? 小編在這時呢，最愛揪朋友去 KTV 唱歌了。特別是當人手一支麥克風，一同唱出周華健經典的 「朋友」 時，當下真的會覺得平常所遇到的任何難關真的都沒什麼大不了的。其實，不只是我們，在 PCR 的過程中，難免也會遇到一些問題，這時就需要透過一些好朋友的幫助，共同闖蕩這些關卡。那這些好朋友們有誰呢？就讓我們來一同認識一下……

PCR 最大的特色在於能在短時間內，將少量特定的 DNA 或 cDNA (complementary DNA, cDNA) 大量擴增。但有時，DNA 並不會如預期增加，或是放大的片段是非專一性的產物 (nonspecific product)。這些問題的產生多數來自於結構問題。DNA 過長或是富含 GC (GC rich) 序列就會增加 PCR 的困難度，導致產率的降低。除了 DNA 結構問題，反應溶液也是一個重點，含有過多鹽類及有機溶劑會使 DNA 沉澱而不易增加。含有介面活性劑 (SDS) 及螯合劑 (EDTA) 則會降低 DNA polymerase 的活性。此外，像是 DNA polymerase 的熱穩定性 (thermostability) 也是 PCR 中常遇見的關卡。

你們平常在玩遊戲時有沒有發現，在面對層層難關時，我們都會找夥伴組成隊伍，各自發揮自己的專長互相幫助，破解各道關卡。而在 PCR 中也有相同的情形，當 PCR 的過程中遇到剛剛提到的各式問題時，我們就會加入不同的添加物，使反應可以順利進行。接下來，我們就來介紹幾種常用的添加劑！

1.     開路先鋒，打開模板、解二級結構

甜菜鹼 (Betaine) 、二甲基亞碸 (Dimethyl sulfoxide, DMSO) 及甲醯胺 (Formamide) 等溶劑，他們會與 DNA 模板中的 cytosine 作用，使雙股更容易打開減少二級結構。Primer 及 DNA polymerase 便較容易結合上二級結構較多的模板，並開啟整個 PCR 反應。所以用於對付 GC rich 序列是個非常有用小幫手，是不是超像隊伍中披荊斬棘的開路先鋒！

另外還有 7-deaza dGTP。他是 dGTP 的類似物，會偷偷取代 dGTP 成為新合成 PCR 產物的一部分，使新合成的 DNA 模板相對容易打開，且不容易形成二級結構，因此同樣適用於 GC rich 序列。

2.     團隊中的坦克，保護酵素增加熱穩定性

一個團隊中都會有可以保護團隊的角色，而在 PCR 的過程中，牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin, BSA) 及明膠  (Gelatin)，他們彷彿團隊中的坦克，可以保護 DNA polymerase，增加其熱穩定性 (thermostability)，並減少 DNA polymerase 管壁吸附的情形。能有效使循環次數較多的 PCR 過程順利進行。上述提到的坦克也是蛋白質所組成，所以也可以吸怪! 將原本會攻擊 polymerase 的怪吸走，讓反應順利進行。

3.     特別的助手

有一位功能顯然與其他人完全不同，但卻也是常用的添加劑之一——四甲基氯化銨 (tetramethylazanium, TMAC)。它不但不會協助 DNA 雙股打開，甚至會抑制 DNA polymerase 的活性，並增加 primer 的黏合溫度。那為何還要將其作為添加物呢？

原來，不同於生物體內 (in vivo) 的基因複製，PCR 缺乏調控基因複製的機制，在這樣的條件下，就容易產生非專一性的產物 (nonspecific product)。此時，TMAC 透過增加 primer 的黏合溫度，減少其非專一性的黏合，就可增進產物專一性。宛如組織隊伍的領隊一般，雖然會稍稍降低隊伍活力，但對於整個隊伍的行動精確性有不可或缺的影響。

有了上述的介紹，是否對於 PCR 的添加物有了一定程度的了解了呢？往後如果碰到有關 PCR 的難關時，先別急著改變反應條件，想想各個小夥伴的功用，並在適當的濃度下使用，說不定就能成功完成 PCR 了！ 為了方便各位進行實驗，在此附上各個添加劑的建議濃度，那就希望各位都能順利完成實驗囉！

PCR 添加劑建議濃度表

添加劑	應用於	建議濃度
7-deaza dGTP	放大 GC rich 序列	依 dGTP 濃度做變化，可完全取代 dGTP 加入反應中。或著 7-deaza dGTP: dGTP=3:1
Betaine	放大 GC rich 序列	0.1 M ~ 3.5 M
DMSO	放大 GC rich 序列	2 ~ 10%
Formamide	放大 GC rich 序列	1 ~ 5%.
BSA	增加 PCR polymerase 穩定性	0.01 µg/µl ~ 0.1 µg/µl
TMAC	減少非專一性的黏合	15 ~ 100 mM

http://www.genelink.com/

資料來源

1. BMC Research Notes, 2012; 5:257

2. Mol Pathol, 2002; 55(1): 55–57.

3. Nucleic Acids Research, 1995; 23(16): 3343-3344

4. Promega Notes, 1998; 65: 275.

5. M40-3021-PCR_Additives_Ver5.1.doc