長的！哎呀！我的 band 出不來啊！—— Long Range PCR

整理・撰文：李俊廷

蓋一棟高樓大廈並不是一件簡單的事，從力學角度來說，高樓大廈的梁柱必須承受比一般房子更大的壓力，同時，樓側需要抗衡強風的受力面積也超過一般的建築。你能想像要經過如何精密的計算才能設計出長長的高塔嗎？如同長長的高塔難以用一般的建築方式完工，長長的 DNA 片段也不易以一般的 PCR 條件製備。在這次的溫故知新小天地裡，小編將簡單介紹長片段聚合酶連鎖反應 (Long range PCR, L-PCR) 這項字面上看似簡單，骨子裡卻不單純的技術。

長片段聚合酶連鎖反應 (Long range PCR, L-PCR) 泛指那些產物約在 5 kb 以上，難以使用一般 PCR 條件或試劑取得預期產物的反應。實驗室新手可能對整個 PCR 反應的認識還不深，所以並不清楚合成 1 kb 的目標和合成 5 kb 的目標比起來有什麼不一樣？然而，若是目標尺度被放大，很多一般 PCR 時可以忽視的現象就會浮現出來，造成 L-PCR 的難度有別於一般的 PCR。

  接下來將以三種角度與一個面相來說明 L-PCR 的困難點到底在哪裡：

  第一種角度，進行一般 PCR 時，你的目標基因若沒有出現 GC rich 的特徵，應該就不太會產生二級結構。然而，進行 L-PCR 時，你的目標序列是一般目標序列的好幾倍長，因此形成二級結構的期望值就是一般 PCR 的好幾倍。如果這些在模板上的二級結構無法在 PCR extention 時解開，那麼 DNA 聚合酶在進行合成反應時將無法以這些區域作為模板而中止反應。建議可以在反應時加入一些解二級結構的試劑來改善這個問題。

  第二種角度，L-PCR 熱循環時間比一般 PCR 還要久，在持續高溫的環境下，單股狀態的 DNA 容易產生突變性的化學變化。例如，dC 發生脫胺反應變成 dU，或是 dA、dG 發生脫嘌呤反應變成 dX。如果你的實驗不允許目標序列突變，那麼你可能會因為 L-PCR 而面臨慘痛的失敗。建議可以減少 PCR denature 的時間，或是使用合成速率較高且校正功能較強的 DNA 聚合酶來改善此問題。

  第三種角度，L-PCR 比一般 PCR 需要更多的 dNTP 原料來合成相同數量的產物。當原料的提供不足以維持 PCR 系統的穩定時，你的整體反應效率將會無法達到預期的結果，甚至開始製造一些因為效率低下而產生的非目標產物。雖然這個效應在 PCR 反應的後期才會逐漸浮現，但在某些特定實驗上卻是一項該考慮的因素。建議可以適量增加 dNTP 的用量來改善這個問題。

	Routine PCR	Long Range PCR	PCR 影響	解決策略
二級結構問題	低	高	無法使用模板而終止反應。	添加解二級結構的添加劑
熱循環時間	短	長	1. DNA 突變率上升。 2. 終止 PCR 反應。	減少變性時間 (denature time)
dNTP 消耗量	少	多	降低 PCR 反應效率。	提高 dNTP 濃度

圖2. Routine PCR 與 L-PCR 的簡易比較。

  說完了三個角度，現在我們來談談一個面相：

  這段小編想跟大家談的那「一個面相」到底是什麼呢？可能已經有聰明的讀者想到了，那就是---市面。目前大部分實驗室的 PCR 酵素都是用買來的，小編希望能藉由對市面上 PCR 酵素的簡單介紹來幫助各位讀者更認識自己使用的藥劑。現在市面上的 PCR 酵素大部分都是從 Taq 或 Pfu 改造而來的。Taq 系列的酵素合成速度較快，但沒有校正的能力。當使用 Taq 系列的酵素進行 L-PCR 時，錯誤配對產生的 mismatch 容易讓 Taq 系列的酵素無法繼續進行反應而從模板上脫落。而 Pfu 系列的酵素雖然具有校正能力，但合成速度較慢，需要在 PCR 反應中忍受更長時間的高溫環境。從酵素特性來看，Pfu 系列的酵素若是在合成反應時遇到模板上出現 dU (高溫脫胺反應)，就會像卡到陰一樣停下來，並隨後從模板上脫落。因為 PCR 酵素本身的種種「原罪」，L-PCR 才會變得如此困難。

  對於 L-PCR 如此麻煩的對手，科學家有時候會想辦法利用別的方式來避免與其正面對決。例如，使用分區段進行 PCR 的策略，或改用 Gibson assembly 等其他系統來完成實驗。然而，想要與其對抗的科學家也很多。在早些時期，其實就有聰明的科學家嘗試在用 Taq進行 L-PCR 時裡混入具有校正功能的 DNA 聚合酶來移除 Taq 無法移除的 mismatch，企圖要使 Taq 在進行 L-PCR 時能有更好的表現。目前市面上標榜適合進行 L-PCR 的 Taq 系列產品幾乎都有參考這個構想呢！另外，原本合成速度緩慢的 Pfu 在市面上也已經有很多於速度上調教成功的例子，以至於能減少 dU 的出現而更順利的進行 L-PCR。

  隨著日新月異的科技演進，相信人們對 L-PCR 的掌握度將會越來越高。除了一些幫助 L-PCR 的新方法之外，小編也常常在各家實驗室聽到一些特別的小偏方呢！想問問看聰明的各位，還知道什麼其他可以幫助 L-PCR 的好方法嗎？

資料來源：

1.      Wilton, S. 2002. Long-range PCR. eLS. .

(http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1038/npg.els.0003767/full)

2.      Michael J. McPherson, Simon Geir Møller (2006). PCR (Second Edition) pp 47-50. In US: 270 Madison Avenue New York, N Y 10016, In UK: 4 Park Square, Milton Pa. Taylor & Francis Group.

(http://download.bioon.com.cn/view/upload/201201/18181845_7261.pdf)

3.      Peter A. Davies, George Gray (2002).PCR Mutation Detection Protocols Volume 187 of the series Methods in Molecular Biology pp 51-55. Humana Press Inc., Totowa, NJ

(http://link.springer.com/protocol/10.1385/1-59259-273-2:051#page-2)

4.      William Waggott (1998).Clinical Applications of PCR Volume 16 of the series Methods in Molecular Medicine™ pp 81-91. Humana Press Inc., Totowa, NJ

(http://link.springer.com/protocol/10.1385/0-89603-499-2:81#page-1)

圖片來源：

1.   https://www.flickr.com/photos/45525367@N06/4249797240