整理・撰文：郭芷麟
圖片來源 /DNA lab via flickr, CC licensed
Real-time polymerase chain reaction，Real-time PCR（Quantitative real time polymerase chain reaction， Q-PCR）中文翻譯為即時聚合酶鏈鎖反應。相信身為研究生的你我，一定對這項技術並不陌生，這是一項非常常用的技術，不論是基礎研究還是基因檢測都會用到。還記得你在操作這項技術時，會先做哪些動作呢？
是不是都會帶口罩和手套，也會盡量保持操作環境乾淨。而需要這樣做的原因，就是為了避免這靈敏的 PCR 反應，會因為一點點的污染而產生偽陽性。到時，如果這個小小的 data 是你畢業的關鍵，那豈不是就欲哭無淚了！
是不是都會帶口罩和手套，也會盡量保持操作環境乾淨。而需要這樣做的原因，就是為了避免這靈敏的 PCR 反應，會因為一點點的污染而產生偽陽性。到時，如果這個小小的 data 是你畢業的關鍵，那豈不是就欲哭無淚了！
除了盡量使實驗操作環境保持乾淨之外，你有沒有想過利用其他的方式，也可以做到與 real-time PCR 一樣的效果，卻比較不容易出現偽陽性？今天我們就來認識一下另一項技術：nucleic acid sequence-based amplication (NASBA)。
NASBA 早在 1991 年由 J Compton 所建立，J Compton 定義這技術為「a primer-dependent technology that can be used for the continuous amplification of nucleic acids in a single mixture at one temperature.」這段話簡單來說就是：只需一對引子，在某一特定溫度下，就可以持續放大出你所想要的產物。這樣解釋，不知大家有沒有覺得很奇妙？居然只需要固定一個溫度，就可以達到與 PCR 一樣的效果？！
整個 NASBA 反應過程所需要的材料為：avian myeloblastosis virus (AMV)reverse transcriptase (RT)、T7 RNA polymerase 和 RNase H 以及一組oligonucleotide primers。簡單來看就是一組 DNA primer 以及三種不同的酵素！反應過程只需 90~120 分鐘，就可以將產物放大到 1012 倍。現在我們就來細細了解一下這技術是怎樣作用的吧！
NASBA 早在 1991 年由 J Compton 所建立，J Compton 定義這技術為「a primer-dependent technology that can be used for the continuous amplification of nucleic acids in a single mixture at one temperature.」這段話簡單來說就是：只需一對引子，在某一特定溫度下，就可以持續放大出你所想要的產物。這樣解釋，不知大家有沒有覺得很奇妙？居然只需要固定一個溫度，就可以達到與 PCR 一樣的效果？！
整個 NASBA 反應過程所需要的材料為：avian myeloblastosis virus (AMV)reverse transcriptase (RT)、T7 RNA polymerase 和 RNase H 以及一組oligonucleotide primers。簡單來看就是一組 DNA primer 以及三種不同的酵素！反應過程只需 90~120 分鐘，就可以將產物放大到 1012 倍。現在我們就來細細了解一下這技術是怎樣作用的吧！
圖片來源：Nucleic Acids Research Oxford Journals
Science
反應機制：
1. 一開始，先將酵素以外的反應物 （像是 RNA template、primers……） 混勻在一起反應65°C、 5 分鐘，使 RNA 的二級結構能夠變性打開。在這過程中，帶有 T7 promoter site 的 primer P1 會鍵結到打開後的 RNA strain 上。
² 此時的 RNA template 通稱為 sense strand
² 只要是RNA 分子，皆可作為 NASBA 技術所使用的 template。
2. 之後將酵素在 41°C 的時候加入，反應 90 分鐘。反應過程中 reverse transcriptase (AMV-RT) 會鍵結到模板上，所產生的產物會是 DNA : RNA hybrid 的狀態。
3. 而 DNA:RNA hybrid 上的 RNA 會被 RNase H 水解。留下 single- stranded cDNA。
4. 此時，Primer P2 （primer P2 is specific for a region upstream of the P1 annealing site） 會鍵結上去。接下來就會藉由 AMV-RT 進行延伸 (extension)，並產生出 double-stranded DNA （dsDNA） 的產物。
5. 而合成出的 dsDNA 5’ 末端的序列含有 T7 RNA polymerase promoter site。因此反應便可藉由 T7 RNA polymerase，製造出大量 antisense RNA。
接下來就是重複循環的階段了！也就是所產生出的 antisense RNA 會再次被 Primer P2 所鍵結，之後透過 AMV-RT 產生出 DNA : RNA hybrid 的產物，此時 DNA:RNA hybrid 上的 RNA 也是一樣，會被 RNase H 水解。留下 single- stranded cDNA，帶有 T7 promoter site 的 Primer P1 又會再次鍵結上去，也是藉由 AMV-RT進行延伸 (extension)，並產生出 double-stranded DNA （dsDNA） 的產物。那這樣的產物就又會再次透過 T7 RNA polymerase，製造出大量 antisense RNA。並重新再次進到循環中。
而最初的反應，primer 的濃度相對於 amplifiable RNA 濃度是相當高的，所以對於整個反應來說，不會是一個限速的原因。直到 primer 濃度已經相當低時，循環就會漸趨緩。
那這樣的反應過程，要怎樣與 real-time PCR 一樣可以做到即時偵測產物呢？這便要靠 「Molecular Beacon」 的幫助了！
Molecular Beacon in NASBA
在 NASBA 的反應過程中，偵測產物的方式是藉由 molecular beacons 來做偵測。molecular beacons 為一種單股的髮夾型的核苷酸探針 (hairpin shaped oligonucleotide probes)。其 5' 端具有螢光的標記，而3' 端則是會有消光基團 （quencher）的標定。
一開始當探針尚未與目標序列 hybrid 時，5’ 端與 3’ 端會靠得很近，因此並不會有螢光的訊號出現。一旦可以與目標序列互補的 molecular beacon 與目標序列結合之後，則 5’ 端的螢光基團便會發出螢光的訊號，進而幫助偵測產物的多寡。在整個 NASBA 的反應過程中，molecular beacons 會在 RNA template 打開之後，和目標序列專一且穩定的 hybrid。
1. 一開始，先將酵素以外的反應物 （像是 RNA template、primers……） 混勻在一起反應65°C、 5 分鐘，使 RNA 的二級結構能夠變性打開。在這過程中，帶有 T7 promoter site 的 primer P1 會鍵結到打開後的 RNA strain 上。
² 此時的 RNA template 通稱為 sense strand
² 只要是RNA 分子，皆可作為 NASBA 技術所使用的 template。
2. 之後將酵素在 41°C 的時候加入，反應 90 分鐘。反應過程中 reverse transcriptase (AMV-RT) 會鍵結到模板上，所產生的產物會是 DNA : RNA hybrid 的狀態。
3. 而 DNA:RNA hybrid 上的 RNA 會被 RNase H 水解。留下 single- stranded cDNA。
4. 此時，Primer P2 （primer P2 is specific for a region upstream of the P1 annealing site） 會鍵結上去。接下來就會藉由 AMV-RT 進行延伸 (extension)，並產生出 double-stranded DNA （dsDNA） 的產物。
5. 而合成出的 dsDNA 5’ 末端的序列含有 T7 RNA polymerase promoter site。因此反應便可藉由 T7 RNA polymerase，製造出大量 antisense RNA。
接下來就是重複循環的階段了！也就是所產生出的 antisense RNA 會再次被 Primer P2 所鍵結，之後透過 AMV-RT 產生出 DNA : RNA hybrid 的產物，此時 DNA:RNA hybrid 上的 RNA 也是一樣，會被 RNase H 水解。留下 single- stranded cDNA，帶有 T7 promoter site 的 Primer P1 又會再次鍵結上去，也是藉由 AMV-RT進行延伸 (extension)，並產生出 double-stranded DNA （dsDNA） 的產物。那這樣的產物就又會再次透過 T7 RNA polymerase，製造出大量 antisense RNA。並重新再次進到循環中。
而最初的反應，primer 的濃度相對於 amplifiable RNA 濃度是相當高的，所以對於整個反應來說，不會是一個限速的原因。直到 primer 濃度已經相當低時，循環就會漸趨緩。
那這樣的反應過程，要怎樣與 real-time PCR 一樣可以做到即時偵測產物呢？這便要靠 「Molecular Beacon」 的幫助了！
Molecular Beacon in NASBA
在 NASBA 的反應過程中，偵測產物的方式是藉由 molecular beacons 來做偵測。molecular beacons 為一種單股的髮夾型的核苷酸探針 (hairpin shaped oligonucleotide probes)。其 5' 端具有螢光的標記，而3' 端則是會有消光基團 （quencher）的標定。
一開始當探針尚未與目標序列 hybrid 時，5’ 端與 3’ 端會靠得很近，因此並不會有螢光的訊號出現。一旦可以與目標序列互補的 molecular beacon 與目標序列結合之後，則 5’ 端的螢光基團便會發出螢光的訊號，進而幫助偵測產物的多寡。在整個 NASBA 的反應過程中，molecular beacons 會在 RNA template 打開之後，和目標序列專一且穩定的 hybrid。
說了那麼多 NASBA 是怎樣反應的，那他實際的優點有哪些呢？
Advantages of NASBA
1. 只要藉由三種酵素就可以在 90 分鐘以內就可以將產物放大 109~1012 倍。
2. 這樣的反應過程不需要很貴的加熱儀，因為正個反應溫度只需要在 41°C 的條件下進行。
3. 此技術也可以應用於檢測人類的 mRNA 序列，且不易有 contamination 的現象發生。
4. 適用於檢測的樣品範圍廣。因為 NASBA 技術的反轉錄過程是直接合併到擴增反應中，因此 NASBA 這樣的技術可以算是最適合分析 RNA 樣品的技術。
介紹到這邊，不知道大家對於此技術是否有更進一步的認識了呢？簡單來說，NASBA 就是一種既可以省錢（因為不須昂貴的加熱儀，在 41°C 便可以反應），又可以得到大量產物的一項技術！（可將產物放大 109~1012 倍）
那這樣的技術應用性也相當多，大家可以多想想有怎樣的應用，並期待之後的介紹吧～
1. 只要藉由三種酵素就可以在 90 分鐘以內就可以將產物放大 109~1012 倍。
2. 這樣的反應過程不需要很貴的加熱儀，因為正個反應溫度只需要在 41°C 的條件下進行。
3. 此技術也可以應用於檢測人類的 mRNA 序列，且不易有 contamination 的現象發生。
4. 適用於檢測的樣品範圍廣。因為 NASBA 技術的反轉錄過程是直接合併到擴增反應中，因此 NASBA 這樣的技術可以算是最適合分析 RNA 樣品的技術。
介紹到這邊，不知道大家對於此技術是否有更進一步的認識了呢？簡單來說，NASBA 就是一種既可以省錢（因為不須昂貴的加熱儀，在 41°C 便可以反應），又可以得到大量產物的一項技術！（可將產物放大 109~1012 倍）
那這樣的技術應用性也相當多，大家可以多想想有怎樣的應用，並期待之後的介紹吧～
參考資料：
1. NASBA Technology：http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/NASBA.html
2. 維基百科：https://en.wikipedia.org/wiki/NASBA_(molecular_biology)
3. 台灣維基：http://www.twwiki.com/wiki/NASBA
4. http://www.primagen.com/inner_index.html?http&&&www.primagen.com/retina.html
5. Nucleic acids Research : https://academic.oup.com/nar/article/1115289/?searchresult=1#20041140
6. NASBA 在病毒檢測的應用：http://www.ebiotrade.com/emagazine/content/3/2009_1_29_1/472496D5-6F6E-4D9B-8D43-4C36B46EB995/pdf/16.pdf
1. NASBA Technology：http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/NASBA.html
2. 維基百科：https://en.wikipedia.org/wiki/NASBA_(molecular_biology)
3. 台灣維基：http://www.twwiki.com/wiki/NASBA
4. http://www.primagen.com/inner_index.html?http&&&www.primagen.com/retina.html
5. Nucleic acids Research : https://academic.oup.com/nar/article/1115289/?searchresult=1#20041140
6. NASBA 在病毒檢測的應用：http://www.ebiotrade.com/emagazine/content/3/2009_1_29_1/472496D5-6F6E-4D9B-8D43-4C36B46EB995/pdf/16.pdf
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