RT-PCR vs. Real-time PCR 還在傻傻分不清楚?

整理・撰文：盛威智

(圖為台北市立動物園提供)

動保議題在近幾年是大眾越來越關心的話題，而因棲地減少和破碎化，許多動物都面臨著生存威脅。石虎，是除了可能滅絕的雲豹外，台灣僅存的原生貓科動物，若你在野外看到，你有能力去分辨它與家貓的差異之處嗎? 石虎的耳後有白色的斑塊，雙眼內側有兩道白色條紋，而身上則有很多像錢幣大小的黑色斑塊，下次若遇見牠可別再和一般的貓咪搞混了呢！

生活中常有許多事情會搞混，而種類多變的PCR當然也不例外，大家還記得幾個星期以前向你們介紹的Real - time polymerase chain reaction，qPCR嗎?，今天小編要介紹的是，就算是科學家有時候也會把它跟Real - time PCR搞混的RT-PCR，全名為逆轉錄聚合酶鏈鎖反應(Reverse transcription polymerase chain reaction)

基因表現，是用基因中的資訊去合成基因產物的過程，產物可分為蛋白質和 RNA (tRNA、snRNA等)，基因表現調控了細胞的結構與功能，在多細胞生物中，一個幹細胞在分化的時候，其子細胞的基因表現會受到調控，進而轉變成不同類型的細胞。細胞分化的結果大多是永久且不可逆的，就像是變了心的女友，回~不~去~了…… 其中就是基因表現在搞鬼!!!

生物和醫學領域內了解基因表現的差異，能幫助我們找尋疾病發生的起源及個體的差異性，為此，我們便需要找出方法來對基因表現進行分析。近年來，分析基因表現的方法各式各樣，常用的方法為 Northern blot、in situ hybridization、RNase protection assays 等，然而，這些方式都相當地耗時，但隨著  PCR 技術的發展，RT-PCR 的出現，使我們能以快速且高靈敏的方式去偵測基因表現量。

逆轉錄聚合酶鏈鎖反應(Reverse transcription polymerase chain reaction)， RT-PCR，為傳統 PCR 的一種變形應用，其原理為設計一個特殊的 primer 能結合至 RNA 上，再利用逆轉錄酶 (逆轉錄酶是一類存在於部分 RNA 病毒中具有反轉錄活性、能以單股 RNA 為模板合成 DNA 的酶) 將 RNA 反轉錄為 DNA，稱為complementary DNA (cDNA)，到目前為止是 RT 的部分，接下來則與傳統的 PCR 反應循環一樣，若 RNA 有正確被表現出來，那麼就有能作為模板的 DNA 被擴增放大，完成整個反應後才稱為 RT-PCR。

圖片來源: http://emerginginvestigators.org/wp-content/uploads/2014/02/Hossain-2014-Fig-2.png
 

以下為RT-PCR 常見的 primer 種類：

(1)  Sequence-specific primers ：特色為專一性很高，只與完全互補序列黏合，但靈活性不如後兩者來得好，不同基因的分析皆需要重新設計 primer。

(2)  Oligo (dT) Primers：真核細胞內 > 95% RNA 為 rRNA，所以 primer 選擇上運用 Oligo (dT) primers 進行 cDNA 合成能大幅降低產物的複雜度。這類的primer是利用 Oligo-dT (18-21 mer) 結合至 mRNA 3’端的poly-A上，接者進行反轉錄作用生成 cDNA。然而此反應是在3'端開始反轉錄，難解開的二級結構可能導致不完整的cDNA合成。 (最常見的策略)。

(3)  Random primers：某些情況下，運用 Random primer (6-9 mer) 來進行 cDNA 合成會大幅提升效率。像是細菌 RNA 樣品、 FFPE 導致的 RNA 受損、 poly (A) 序列以及複雜的二級結構皆不適合運用 Oligo-dT Primer 進行 cDNA 合成。上述情況選用 Random primer 能大幅提高反轉錄反應的效率。

圖片來源: https://worldwide.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/pcr-amplification/

RT-PCR 使得 RNA 檢測的靈敏度提高，讓我們在極少量的 RNA 樣品都能夠進行分析，而 RT-PCR除了可以用於偵測 RNA 表現外，甚至還可與 qPCR 的技術合併應用來做基因表現量分析，此方法則另外被稱為 qRT-PCR，其專一性和靈敏度都能提高實驗結果的效率和準確性，用途相當廣泛。

資料來源:

1.     維基百科: https://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction

2.     維基百科: https://zh.wikipedia.org/wiki/%E7%BB%86%E8%83%9E%E5%88%86%E5%8C%96

3.     http://highscope.ch.ntu.edu.tw/wordpress/?p=46138

4.     https://www.thermofisher.com/tw/zt/home/life-science/pcr/reverse-transcription/rna-priming-strategies.html